作者：邹波贤

摘要：为满足转基因食品标记的需要，必须检测鉴定食品中外源基因或其基因产物的有无。对转基因食品检测的方法和最近的发展进行了综述。

关键词：转基因食品  检测方法   食品安全

　　转基因食品主要是指利用基因工程技术改变基因组构成 ,将某些外源基因转移到动物、植物或微生物中去 ,改造其遗传物质 ,使其性状、营养价值或品质向人们所需目标转变 ,并由这些转基因生物所生产的食品。转基因食品也称基因改造食品或基因修饰食品 (GeneticallyModified Food, GMF) 。转基因食品大体上分为转基因植物食品、转基因动物食品和转基因微生物食品。目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm 以上，大量的转基因农产品被直接或问接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。自从 1983年世界上第一例转基因作物烟草问世以来 ,随着转基因作物在全球迅速推广 ,转基因作物产品的市场销售额也迅速增加 ,从 1995年的 0. 75亿美元增加到 1998年的12亿～15亿美元 , 4年间增加约 20倍。从目前的发展趋势预测 ,2010年可增加到 200亿美元 。然而转基因作物在带来巨大效益的同时也存在许多问题:转基因食品的安全性及对生态环境的影响等。因此 ,欧盟和美国、日本等国家先后出台了相应的法律和管理方法 ,对转基因食品实行强制标识或自愿标识;挪威是第一个要求对转基因产品进行含量标识的国家 ,该国对转基因成分的限量标识最低限为2% ;欧盟和瑞士规定食品中 GMF成分超过 1%则必须进行标识; 日本的限量标识为 5% 。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插人的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插人外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插人外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插人位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。

1　转基因技术的基本原理

DNA是生物体内的遗传物质 ,通过 DNA的复制、转录和翻译将遗传信息进行传递和表达。通过对生物体内 DNA分子的修饰改造从而改变生物体的遗传性状 ,这是转基因技术的理论基础。DNA限制性内切酶及基因克隆等技术的发现为转基因操作奠定了技术基础。

转基因技术的主要步骤:分离目的 DNA片断 ,将目的片断克隆到细菌的 DNA中 ,构建重组 DNA,将重组 DNA扩增后 ,利用农杆菌介导、基因枪、化学物质诱导、电穿孔、微注射及花粉管通道等方法将连接了启动子和终止子的目的基因导入到目标植物的细胞中 ,最后筛选含目的基因的转化细胞 ,并诱导产生转基因植株 ,经扩繁后 ,加工生产出转基因食品。

2　转基因食品的检测技术

转基因过程的每一个环节都有可能对食品的安全性产生影响 。针对转基因技术各个环节的特点 ,相应的转基因食品的检测方法主要有两大类:一类是蛋白质水平的检测 ,另一类是核酸水平的检测

2.1 核酸水平

主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种

2.1.1 定性检测

2. 1.1.1　定性 PCR　

聚合酶链式反应 (PolymeraseChain Reaction, PCR)是以特定的基因片段 (DNA片断)为模板,利用人工合成的一对寡聚核苷酸为引物 ,以 4种脱氧核苷酸 (dNTP)为底物 ,在耐高温聚合酶的作用下 ,通过 DNA模板的变性、退火及引物的延伸 3个阶段的多次循环 ,使模板扩增。转基因细胞转入的基因成分一般包括启动子(Promotor)、报告基因 (Reporter Gene)、目的基因(Target Gene)、终止子 (Terminator) ,其中启动子和终止子为表达目的基因所必需的。1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品BtI76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了l4对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。至今 ,转基因植物常用的是花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子 (NOS)。通过 PCR扩增这些特殊的启动子和终止子序列 ,是目前最常用的鉴定食品中有无转基因成分的方法。Shirai等通过对35S启动子、NOS终止子的检测 ,实现了对抗草甘膦大豆 Roundup Ready转基因成分的筛选检测 。曹际娟等对转基因玉米及其粗加工食品 ,如爆米花、熟玉米棒、速溶玉米片的基因进行了 PCR定性检测 。但定性的 PCR方法对转基因玉米原材料的灵敏度比转基因大豆原材料略低 (如检测 0. 1%的转基因玉米种的 35S启动子的假阴性数量是 14个 ,而相应的转基因大豆的 35S启动子的假阴性数量是5个）。PCR方法已经发展为检测转基因 Round2up Ready大豆的方法 ,呈现高度特异性和敏感度(0. 01%GMF) ,适用于从大豆到豆制品、大豆蛋白质、卵磷脂及豆油的半成品和终产品样品 。目前，该方法在检测转基因食品的应用中，还存在一些问题，如从食品中提取DNA的效率，可能存在的PCR抑制剂，DNA的降解，可能存在的RNA，以及选择合适的靶序列的引物来保证扩增的成功等，这些都可能成为制约鉴定结果成功与否的因素。在实验过程中，PCR的污染及条件的重复性是实验判定结果的关键。每一次实验均需要设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。

2.1.1.2　多重 PCR

多重 PCR是常规 PCR方法的改进 ,它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。多重PCR可以同时针对几个靶位点进行PCR技术检测。这种方法具有更大的可靠性和适应性 ,并且能降低检测成本。张平平等为了同时检测转基因食品中所含的多个目标基因序列并排除扩增结果的假阴性 ,采用多重 PCR分析技术对转基因大豆食品进行了检测 ,当转基因大豆含量仅为 0.15%时 ,仍然可以对转基因食品进行可靠的鉴定 ；V．T．Forte等[呀0用其设计的多重PCR方法对转基因大豆和Bt玉米样品进行实际检测，结果表明该方法能够准确的检测食品中是否含有转基因成分，其检测结果可以精确到2％～0．1％的范围；Permingeat等仅用两对引物就可同时检测出转基因玉米 Bt176、MON810、Bt11和 T25的 CryIA (b)和 pat基因。多重PCR也可同时准确地扩增出 Roundup Ready大豆的NOS和 epsps序列片段 ；刘光明根据转基因农作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子 (NOS)的序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针(FDCP) ,分别建立了常规 PCR、应用 FDCP的新型实时荧光 PCR检测转基因成分 35S启动子和 NOS终止子的方法。以上试验结果表明 , 多重 PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点 ,其中多重荧光 PCR法则更为简便、快速、准确 。

2.1.1.3　电化学发光 PCR技术

　电化学发光 (Elec2trochemiluminescence, ECL)是指通过电化学方法产生一些特殊的物质 ,然后这些电生物质之间或电生物质与其他物质之间进一步反应产生的一种发光现象。它是化学发光与电化学方法相互结合的产物 。电化学发光 PCR法首次将电化学发光技术、PCR技术和双探针杂交技术结合起来 , 用于检测 CaMV35S启动子 ,从而判断其是否含有转基因成分。刘晋峰等首次利用该方法检测到 35S启动子的存在 ,并且该方法所用的试剂中没有电泳检测中用到的溴化乙锭、同位素等毒害物质。与传统的凝胶电泳检测方法相比 ,该法操作简便 ,检测转基因植物具有较宽的线性度 , 可望将其发展成为一种定量检测转基因植物的方法。

2.1.1.4巢式和半巢式PCR(nested PCR and semi—nestedPCR)

ESl巢式PCR (nested PCR)是在普通PCR基础上发展起来的一种PCR技术。其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。半巢式PCR(semi nested PCR)的原理与巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有一对半引物，有一个引物被用于二次PCR反应中。这两种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。在DNA受到严重破坏的大豆加工品豆油、大豆磷脂以及其它产品中，用普通PCR不能完全检出是否含有大豆成分和转基因大豆的成分，即使检出，其重复性也不好。而利用巢式PCR和半巢式PCR可以克服普通PCR的这一缺陷。在用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测时，可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的l7个品牌的食品中检测出大豆内标基因(house—keeping gene)ESlLectin。其中2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因CaMV35S—CTP4基因片段，说明这些食品中含有转基因大豆成分，占被检测食品的76．5％。

2.1.1.5核酸印记法(southern blot)  

核酸印记法以放射性或荧光标记的外源目的基因的同源序列作为探针与该食品原料农产品的总DNA进行杂交。首先用限制酶消化受体总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片断，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片断的相对位置保持不变，用放射性或荧光标记的探针与各个DNA片断杂交，经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置。核酸印记法技术用于食品外源基因的检测可检测出外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品的纯度要求较高，费用也较高。用核酸印迹法判断出西红柿的假定的转化株的基因组DNA中含有转入的DNA。Jennings等用核酸印迹法杂交判断Bt玉米中crylAb基因的211 bp片段和玉米内源基因sh2 f编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶的213 bp片段的存在。这种方法准确但是操作复杂费时。

2．1.2 定量检测

2. 2. 4　定量 PCR   由于 PCR具有敏感性和特异性的特点 ,而且食品加工过程中核酸变性程度不如蛋白质 ,因此目前 GMF的定量仍基于 PCR,其中包括半定量 PCR法 (Semi - quantitative PCR)、定量竞争PCR法 (Quantitative Competitive PCR)、实时荧光定量 PCR 法 (Real - time Fluorescence QuantitativePCR)。

2. 2. 4. 1　半定量 PCR　半定量 PCR 是通过同时扩增待测样品和一系列标准样品 (0、0. 1%、0. 5%1%、2%、5% GMF 含量 ) 的共有核酸成分 , 如CaMV35S启动子 ,凝胶电泳扫描定量 PCR产物 ,由标准品建立的标准曲线来判定待测样品中转基因成分的含量。

2. 2. 4. 2　定量竞争 PCR　选择由突变克隆产生的含有一个新内切酶位点的外源竞争性模板。在同一反应管中 ,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增 (其中一个引物为荧光标记 )。扩增后用内切酶消化 PCR产物 ,竞争性模板的产物被酶解为两个片段 ,而待测模板不被切割 ,可通过电泳或高效液相将两种产物分开 ,分别测定荧光强度 ,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数 。

2. 2. 4. 3　实时荧光定量 PCR　实时荧光定量 PCR技术,是指在 PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。实时荧光定量PCR技术是在常规 PCR基础上,添加了一条标记了两个荧光基团的探针,一个标记在探针的 5′端 ,另一个标记在探针的 3′端。两者可构成能量传递结构 ,当两者距离较远时 ,抑制作用消失 ,报告基团荧光信号增强。荧光信号随着 PCR产物的增加而增强。实时定量 PCR 方法就是利用此原理 ,在 PCR过程中 ,连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。因为循环参数 (Ct值 ) 和 PCR体系中起始 DNA量的对数值之间有严格的线性关系 ,根据阳性梯度标准品的 Ct值就可以准确确定起始 DNA的数量 。陈颖等还用同样的方法对转基因大豆 Roundup Ready进行检测 , 检测灵敏度 <0. 01%,0. 01%的检测灵敏度已完全能够满足转基因检测的需要。实时荧光定量 PCR可在提取 DNA后 3 h内测出 1 g样品的总 DNA量中 2 pg的转基因成分 ,最具应用前景。但主要缺点是荧光标记探针会在一些食物基质中水解;另外 ,操作的仪器较贵 。

2. 1.3　Southern　

Southern杂交是通过对特异性探针结合的基因组 DNA片断内或其周围序列进行限制性内切核酸酶酶切位点作图来研究基因在基因组内部是如何组织排列的。在转基因食品中用Southern技术 ,是要在知道该转基因食品转入外源基因片段的情况下使用的。该技术可检测出食品外源基因与内源基因有高度同源性的 DNA片断 ,且准确可靠 ,但对样品的纯度要求较高。

2. 1.4　Northern　

与 Southern不同 , Southern是以DNA为杂交对象 ,而 Northern杂交对象是转基因食品里的 RNA。

2. 1.5　基因芯片 　

基因芯片是 20世纪 80年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术 ,是由大量 DNA或寡核苷酸探针密集排列的矩阵 ,基因芯片可以将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片段 (靶片段 )固定于玻片上制成检测芯片 ,将从待检样品中提取的 DNA扩增、标记后与芯片进行杂交 ,杂交信号由芯片扫描仪检测 ,再经计算机软件进行分析判断。基因芯片技术可对样品进行集约化和平行处理 。随着转基因食品的迅速发展 ,转基因食品检测技术也在飞速发展。近几年 ,基因芯片技术和 DNA生物传感器等新技术的研究取得了新的进展 ,利用基因芯片和生物传感器技术是今后一段时间内转基因监测技术的研究方向之一。同时高通量、高灵敏度、自动化和低成本的检测技术是未来的发展趋势。

2. 2  蛋白质水平的检测

2. 2. 1　酶联免疫法 (ELISA) 　

ELISA检测是将抗原和抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来 ,根据酶作用于底物后的显色反应 ,当抗原与抗体结合时 ,借助于比色或荧光反应鉴定 GMF。酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比。ELISA检测对样品进行定性检测的同时又能进行定量分析 。Rogan等人用 ELISA法检测出传统大豆加工产品中混有 2%Roundup Ready大豆中的 CP4EPSPS蛋白质 。此方法具有选择性和灵敏性 ,具有商业可利用性;但是免疫测定的主要缺点之一是复杂基质对它的准确性和准确度有干扰 ,并且外源基因表达的蛋白质在较低水平或热处理变性时 ,免疫方法的检测能力就会下降，如加工的蔬菜和食品。实际上，许多存在于食物基质中的物质，如表面活性剂(皂角苷)、酚化物、脂肪酸、内源磷酸(酯)酶，均可以抑制特异的抗原一抗体相互作用。ELISA 检测目前已有商品化的转基因食品ELISA检测试剂盒 ,但只能检测少数几种转基因食品 ,且一种试剂盒只针对一特定转基因产物 ,无法高通量、快速地检测具有多种混合成分的食品样品 ,并且价格很高。

2. 2. 2　试纸法　

主要将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上 ,当纸上抗体和特异抗原结合后 ,再和带有颜色的特异抗体进行反应 ,就形成了带有颜色的三明治机构 ,并且固定在试纸条上 ,如果没有抗原 ,则没有颜色。此法不需要特殊的仪器设备 ,适用于现场检验或初筛 。

2. 2. 3　蛋白质印迹法 (Western Blot) 　

蛋白质印迹法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来 ,是检测复杂混合物中特异蛋白质最有力的工具之一 ,普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质 ,灵敏度为 1～5 ng。它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质 ,特别是用于不可溶蛋白质的分析。Van Duijn等人用蛋白质印迹法检测 Roundup Ready大豆中的CP4合成酶 ,检测限在 0. 5% ～1%。经验证 ,这种方法可以应用于转基因 Roundup Ready大豆原材料和大豆蛋白质产品的检测。蛋白质芯片技术将是未来筛选食品中多种转基因成分的最佳方法。   

2．2. 4“侧流”型免疫测定(Lateral Flow)

“侧流”型免疫测定是在最近15年发展起来的，该方法之前主要用于医学领域。与ELISA相似，这种测定方法也是基于三明治夹心式技术原理，但该法是在一种膜支持物上，而不是在管子里进行的，标识的抗原一抗体复合物侧向迁移，直至遇到在一种固定表面上的抗体。整个操作相对简单，目前市场上也出现了用于侧流分析并能用于野外测试的试剂盒。

2.  3 其它检测方法

随着国内外对转基因产品检测研究的深入以及各国对转基因产品检测要求的提高，迫切地需要更准确、快速、安全、高效且成本低廉的检测技术的问世。除了上面介绍的方法外，还有一些其它的检测方法。目前，色谱技术(HPLC)、近红外波谱技术(NIR)、毛细管电泳技术(CE)、超分支滚环扩增技术(HRCA)以及基于一些成熟技术建立起来的试剂盒技术、试纸条技术在转基因食品的实际检测中都有所应用。

3   我国转基因食品的展望和现状

转基因食品作为现代生物技术的一种高科技产物，所产生的社会和经济效益是十分显著的。尤其对于我国这样一个人多地少的国家而言，转基因食品的发展显得尤为重要。 但是我们在关注这些显而易见的好处的同时，必须注意到可能由其带来的潜在的安全性问题。任何技术都是双刃剑，本身并无好坏之分。应用得好，可以造福人类；反之，就会带来问题。对于转基因技术的发展，一方面积极稳妥的对转基因食品进行研究开发，另一方面严格把关，加强对其的监督管理，制定出操作性强的安全评价细则，同时加强相对滞后的转基因食品检测技术的研究力度，转基因食品的检测方法多种多样，各有其优缺点。在实际的检测中，并非任何一种检测方法对某种转基因食品的检测都行之有效。应该根据食品种类和加工类型的不同，以及食品中可能含有的转基因片段的不同，选择最有效的检测方法。同时，现有的检测方法也在不断的改进中，随着各国有关转基因成分标签法的建立和不断完善，对转基因成分的准确定量检测显得日趋重要。这样既可以保证广大人民群众的利益，又可以促进转基因食品的健康发展。

从 1997年起，我国政府受理在中国境内从事基因工程研究、试验、环境释放和商品化生产的转基因植物、动物、微生物的安全评价与审批，对转基因生物及其产品的商品化生产进行了严格的安全评价。至 2001年，农业部已经受理了 10批共700多项农业转基因生物安全评价申请。2001年，我国又颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，并制定了《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》，要求从2002年3月20日起，含有转基因成分的大豆、番茄、棉花、玉米、油菜等 ! 种农作物及其产品*如大豆油+需采用规范中文标明转基因成分才能加工和销售，未标明或不按规定标明的，不得进口或销售，同时要按危害程度对农业转基因生物进行分级。这些法规和办法为我国市场上的转基因食品的安全设下道道防线。我们相信，随着对转基因食品检测技术的不断进步，转基因食品安全性评估体系和安全卫生监督管理办法也将不断健全和完善。转基因食品将具有极为广阔的前景和美好的未来，并将成为21世纪人类解决粮食安全问题的一条重要途径。

我国很重视转基因技术在农作物上的应用研究，并在不同作物中相继获得成功，如中国农业科学院的转基因抗虫棉，中国水稻研究所的转基因杂交水稻，北京大学的抗病虫害番茄、甜椒等，并首创将鱼的耐寒基因植入西红柿，得到了转基因抗寒西红柿。据不完全统计，我国目前已有番茄、甜椒、抗虫棉等 6个品种获准投入商品化生产。1999 年我国种植转基因农作物约 30万公顷（以蔬菜和棉花为主），种植面积仅次于美国、加拿大、阿根廷，居世界第四位 。2002年我国转基因作物种植面积突破210 万公顷，成为继美国、加拿大、巴西、阿根廷之后的转基因作物种植大国。

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